图1 用于从CR30结晶器中纯化不同DNA组分的工作流程示意图。CdDNA，用离心法获得的溶解DNA；dDNA，溶解DNA；eDNA，胞外DNA；FdDNA，溶解DNA，采用过滤法获得的溶解DNA；iDNA，细胞内DNA（来自细胞颗粒）；vDNA，病毒DNA。

结果与讨论1 离心法诱导dDNA研究中出现人为误差用两种不同的方法去除细胞，得到CR30水样品中的dDNA：高速离心+过滤（“C”方案）或连续过滤步骤（不离心）（“F”方案）（图1）。方案C的dDNA回收量较高（以下简称：CdDNA，19.04 μg l−1）而F方案较低（以下简称：FdDNA，μg l −1），这一结果表明，高速离心可能会导致偏差（图2A）。这些dDNA值低于先前报道的深层高盐缺氧沉积物（338 ng g−1-343ng g−1），但与海洋环境相似（贫营养海洋为0.03 μg l−1，中等营养的河口为44 μg l−1）和淡水环境也相似（0.5-25.6 μg l−1）。然而，这些小心对待这些公布的数据，因为不同的研究往往采用不同的技术定量DNA，在一些研究中，游离病毒DNA没有从dDNA池中分离出来，因此病毒衣壳内的DNA也被错误地认为是dDNA部分的一部分。

图2 CR30溶解DNA（dDNA）的主要特征。A.CR30-dDNAs的浓度：顺序过滤（F样品）、离心+过滤（C样品）。B.溶解DNA组分的电泳。箭头表示存在高分子量（>20kb）的DNA条带。

通过电泳评估了CR30 CdDNA和FdDNA的片段尺寸，结果表明主要为0.5-1.5kb的核酸。此外，还观察到较大尺寸的dDNA，可能对应于病毒基因组、质粒或染色体片段（图2B）。这些结果与在2016年12月采集的CR30结晶样品分析结果类似（数据未展示）。这些dDNA的尺寸与海水中观察到的更为相似（范围为0.12-35.2kb，小片段占优势），而与淡水区别较大（0.1 to 0.5 Kb）。CdDNA包含的片段比FdDNA片段中的片段稍小，后者显示出更大的DNA量（见图2B中的箭头）。这种差异可能部分是由于离心造成的细胞损伤和随后释放的胞内核酸酶引起的，这些核酸酶可以主动降解溶解的DNA。为了更深入地探讨不同方法对dDNA回收率的影响，通过16Sr RNA基因DGGE图谱测定CdDNA和FdDNA中DNA的起源，并与CR30细胞组分（以下简称iDNA，来自细胞内DNA）的起源进行比较。古细菌DGGE-iDNA模式与在CdDNA和FdDNA中发现的模式相同（图S1）。然而，细菌引物未能扩增两个dDNA组分中的16Sr RNA基因。这一结果表明，如果存在，来自细菌来源的溶解DNA低于标准PCR的检测限，并且表明细菌细胞比它们的古细菌对应物更耐高速离心诱导的损伤。值得注意的是，通过离心（CiDNA）和过滤（FiDNA）收集的细胞组分的组成几乎相同，正如通过16S代谢物编码估计的结果（图S2）。为了更好地描述FdDNA和CdDNA，进行宏基因组学研究。为此，对CR30衍生的FdDNA、CdDNA、iDNA和vDNA（来自病毒DNA）部分进行测序（表1）。Nonpareil分析表明，测序深度(表1)高于60%的推荐阈值，可以建立不同数据集之间的比较，并获得有意义的、无偏倚的生物学结论。然后，将CdDNA和FdDNA读长与来自iDNA和vDNA宏基因组的读长进行比较。BLASTN PCA分析表明，iDNA更类似于CdDNA而不是FdDNA（图3A和B）。这种聚类也与不同宏基因组（vDNA除外）的分类学组成具有良好的一致性，无论是考虑到所有的宏基因组读长还是仅考虑16S rRNA基因读长（图4）。事实上，根据16S rRNA基因宏基因组图谱，三个组分中最丰富的属是Haloquadratum，其在CdDNA中的比例（57%）比在FdDNA组分中的比例（42%）更接近iDNA中的比例（63%）（图4A）。此外，最丰富的CR30细菌S. ruber，在iDNA中被检测到（2%），但在CdDNA中（0.6%）显示出较低的丰度，而在FdDNA中则没有。这一结果可以解释上述细菌PCR产物的缺失，也与我们之前的分析结果（数据未展示）一致。基于非16S宏基因组读取的分类图谱也获得了类似的结果（图4B）。表1 本研究分析的宏基因组的一般特征。