图1 GSDMD切割后N端表达的调控因子筛选系统

为了鉴定找到促进在GSDMD切割后促进核孔形成以及焦亡的因子，作者们构建了一种遗传筛选系统。该系统利用了GSDMD的N端单独表达就足以诱发凋亡这一现象【1,2】，从而能够避免上游诱导细胞凋亡产生的事件。作者们在永生化的小鼠骨髓源性巨噬细胞（immortalized bone-marrow-derived macrophages，iBMDMs）中稳定表达了转录激活因子，能够分别诱导N端以及全长的GSDMD的转基因表达。作者们发现在细胞中分别诱导N端以及全长的GSDMD表达后，只有N端而非全长的GSDMD可以导致膜穿透性染料碘化丙啶（Propidium iodide）的渗入以及乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）的释放。LDH只有在细胞裂解后才能够释放【6】。由此，作者们建立起了一种能够独立于炎症小体直接诱导GSDMD膜孔形成活性的实验系统，从而能够特异性识别介导该过程的调节因子。

为了找到调节GSDMD孔隙形成的关键因子，作者们利用前面介绍的系统进行了一个全基因组CRISPR-Cas9为基础的筛选。从该筛选中作者们鉴定发现了与mTOR调控相关的复合体Ragulator-Rag（图2）。为了证明筛选到的Ragulator-Rag复合体的确参与到GSDMD孔隙形成过程中，作者们对复合体中的不同组分进行了遗传删除。作者们发现，其中RagA删除的细胞中碘化丙啶入核明显降低。这些结果说明Ragulator-Rag复合体对于GSDMD介导的孔隙形成以及细胞焦亡非常关键。

图2 Ragulator-Rag复合物

Ragulator-Rag复合体对mTOR信号具有非常关键的调控作用，因此作者们想知道mTOR是否也参与到GSDMD的N端介导的孔隙形成过程中。作者们发现，mTOR的活性的确为GSDMD介导的孔隙形成所必须，而且mTORC1而非mTORC2参与到细胞焦亡之中。

那么，Ragulator-Rag-mTORC1信号通路是如何调节GSDMD介导的膜孔形成的呢？作者们进行了Ragulator-Rag组分的敲除，并对GSDMD切割后活性发挥膜定位以及寡聚化这两个主要的步骤进行了检测。作者们发现，RagA或者RagC的敲除并不会影响GSDMD在膜上的定位，但是确会显著地影响GSDMD的寡聚化。进一步地，为了建立Ragulator-Rag复合体与GSDMD寡聚化之间的联系，作者们考虑将孔隙形成与线粒体活性破坏【7】这一现象进行联系。为此，作者们使用MitoTracker以及电位染料对GSDMD的N端所介导的核孔形成后对线粒体活性的影响进行检测。作者们发现，线粒体活性以及与之相关的ROS均会介导GSDMD的寡聚化。因此，线粒体的健康和ROS的产生促进了GSDMD的寡聚化和膜孔的形成。

图2 工作模型