导读

西洋参是一种重要的中草药，具有抗炎、抗氧化特性，增强中枢神经系统功能，保护心血管，提高免疫力等药理作用。2018年全球西洋参市场达到8500万美元，预计2019-2024年将达到7033吨。中国是西洋参的第三大生产国，2016年生产西洋参3600吨。然而，制约其产量的一个重要问题就是连作障碍。连作通常导致幼苗成活率降至30％以下。一般认为，连作障碍是由许多生物和非生物因素引起的，例如土壤理化性质的恶化，植物的自毒作用以及微生物群落多样性和组成的变化。土壤微生物群落的改变与土壤理化性质，土壤酶活性，植物品种和土壤环境类型有关。许多其他因素也可以直接或间接影响土壤微生物群落的空间结构，例如土壤水分，氮和磷的含量。然而西洋参连作导致土壤微生物群落结构和组成变化的原因，及再植玉米可以有效改善土壤微生物群落的理论基础尚不清楚。本研究以新收获一茬的西洋参田（B），收获西洋参后分别再植玉米2年（C），4年（D）和6年（E）的田地土壤为研究对象，以未种过西洋参的玉米田（A）的土壤为对照，采用高通量测序及常规土壤理化分析等技术，测定了土壤中微生物群落结构及组成，理化性质及酶活性，分析土壤微生物群落与土壤环境因子变化的相互作用关系。结果发现：种植过西洋参的土壤中土壤盐、NH4+-N、NO3--N的含量显著增加，而土壤pH、碳氮比、碱性磷酸酶和纤维素酶活性显著降低，细菌多样性降低，真菌多样性和丰富度增加。Pearson相关分析表明，微生物群落的显著变化与土壤pH、土壤盐和氮含量、碱性磷酸酶、纤维素酶活性的变化显著相关。我们发现显著降低的土壤pH值和增加的土壤盐含量是导致西洋参连作障碍的关键因素。总之，土壤pH，土壤盐分和氮含量的变化会导致微生物群落结构和组成以及纤维素酶和碱性磷酸酶活性的变化，最终导致西洋参的连作障碍，并可通过再植玉米而得到改善。

论文ID

原名：Changes in physicochemical properties, enzymatic activities, and the microbial community of soil significantly influence the continuous cropping of Panax quinquefolius L. (American ginseng)

译名：土壤理化性质、酶活性及微生物群落的变化显著影响西洋参的连作

期刊：Plant and SoilIF：3.299发表时间：2021.3.4

通讯作者：王喆之，王世强

通讯作者单位：陕西师范大学生命科学学院

实验设计

1 实验设计与样品采集 2015年在陕西省留坝村采集土壤样品。实验一共分为5个组：未种过西洋参的玉米田（A），新收获一茬的西洋参田（B），种植过西洋参的2年（C），4年（D），6年（E）再植玉米田；采用五点取样法在每个田中采集5个代表性样本，重复3次。样品过2 mm筛，储存在-80 ℃进行测序分析。

2 土壤理化性质及土壤酶活性的测定 对土壤进行风干，分析土壤电导率(SE)、盐分含量(SS)、土壤全有机碳(SOC)、全氮(TN)、全磷(AP)和速效磷(AP)。采用新鲜土壤样品测定土壤pH值和土壤铵态氮(NH4+-N，AN)、硝态氮(NO3--N，NN)含量。 用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定脲酶活性(EC3.5.1.5)。蔗糖酶(EC3.2.1.26)和纤维素酶的活性(EC3.2.1)采用DNS根据糖含量的降低进行比色测定。采用磷酸苯二钠比色法估算总磷酸酶活性。采用三苯四氮唑还原法测定土壤脱氢酶活性。过氧化氢酶(EC1.11.1.6)活性采用高锰酸钾滴定法测定。

3 DNA提取，PCR扩增及数据分析 使用DNATM试剂盒(Sigma-Aldrich，德国)提取样品中微生物DNA。通过PCR扩增细菌的16S rRNA基因V4高变区和真菌的18S rRNA基因ITS1区。PCR产物从2.0%琼脂糖凝胶中分离，使用QIAquick凝胶提取试剂盒进行纯化。Illumina MiSeq采用配对末端法，对V4和ITS1扩增子进行测序。 以97%的相似性阈值对细菌和真菌OTUs进行聚集，去除嵌合序列，并利用QIIME中的UCLUST方法对高质量序列进行聚类。OTU级alpha多样性指数，例如Chao1，ACE、Shannon和Simpson指数，均采用OTU表计算。采用UniFrac距离度量方法，对不同样品进行β多样性分析，以研究微生物群落结构的变化，并通过主坐标分析（PCoA）、非度量多维标度（NMDS）和算术平均无权对群（UPGMA）分层聚类实现可视化。组间成对比较的UniFrac距离差异通过Student's t检验和Monte Carlo permutation检验确定。分类组成和丰度可视化使用MEGAN 和GraPhlAn。在门、纲、目、科、属和种水平上，使用Metastats对组内或组间的物种丰度进行统计比较。

结果

1 土壤理化性质

土壤理化性质如图1所示。与A组相比，B组SM和SOC无显著变化(Fig. 1a, e)，而SE、SS、TN、NN显著升高。并且玉米再植时间越长，SE、SS和NN水平越接近A组。随着玉米再植时间的延长，C组TN先降低后升高达到B组水平；E组TN显著高于B组(Fig. 1c, d,f, h)。同时，A组和B组间AN和AP呈相似的上升趋势，其次随着玉米再植时间的延长，AN逐渐下降(Fig. 1g, j)。相反，B组土壤pH值显著低于A组；随着玉米再植时间的延长C,D,E组土壤pH值显著升高，但未达到A组水平(Fig. 1b). 同样，B组的CN和TP明显低于A组，C组继续下降，D组逐渐恢复，E组恢复到A组水平(Fig. 1k, i)。

图1 土壤理化性质的变化。

2 土壤酶活性图2比较了各组土壤的酶活性。和A组比较，B组的中性磷酸酶活性显著升高（Fig. 2a），而碱性磷酸酶（Fig. 2b）和纤维素酶（Fig. 2d）活性较低。各组间总磷酸酶（Fig. 2c）, 脱氢酶（Fig. 2e）, 脲酶（Fig. 2f）, 酸性磷酸酶（Fig. 2g）,蔗糖转化酶（Fig. 2h）及过氧化氢酶（Fig. 2i）活性无显著差异。C组碱性磷酸酶活性显著低于B组，D组明显高于B组。虽然随着玉米的再植，碱性磷酸酶活性有增加的趋势，但是E组的碱性磷酸酶活性并没有达到未种植西洋参土壤中的酶活性水平(Fig. 2b)。C组纤维素酶活性显著高于B组。较高的纤维素酶活性与玉米再植时间延长直接相关；E组纤维素酶活性接近A组水平(Fig. 2d)。脱氢酶活性呈逐渐升高的趋势(Fig. 2e)。

图2 土壤酶活性的变化。

3 Alpha多样性

OTU稀疏和秩-丰度曲线表明获得了足够的测序数据(Fig. S1)。通过alpha多样性分析（Chao，Ace，Shannon，Simpson）(Table S2)，我们发现种植西洋参后土壤细菌多样性水平呈下降趋势，再植玉米后显著上升；而种植西洋参后土壤细菌丰富度上升，再植玉米后下降。此外，种植西洋参后，土壤真菌多样性和丰富度均呈上升趋势，再植玉米后则进一步升高(Fig. S2e,f,g,h)。

4 细菌和真菌群落的结构组成

15份样品共检出47种不同的细菌门。丰度最高的是拟杆菌门（14.2%-28.2%）和变形菌门（12.7%-23.7%），其次是Planctomycetes（11.5%-19.6%）、酸杆菌门（10.6%-13.6%）、放线菌门（8.1%-14.1%）、芽单胞菌门（4.1%-6.5%）、疣微菌门（3.8%-6.3%）和绿弯菌门（2.6%-5.7%）(Fig. 3a)。此外，Planctomycetia在Planctomycetes中（A、C和E组分别为10.3%、10.8%和11.1%）是优势菌群，变形菌门中的α变形菌（10.4%）在B组中占优势，α变形菌在A、B、C、E组分别占9.50%、6.90%、8.30%和6.80%。15个样品共检出6个不同的真菌门，以子囊菌门为主（61.9%-70.3%），担子菌门和接合菌门分别占7.6%-8.6%和3.6%-10.1%(Fig. 3b)。此外，与A组相比，B组伞形霉菌丰度减少，且随着玉米再植时间的延长而逐渐增加。然而，B组的假单胞菌和银耳纲菌比A组多，当玉米再植期达到6年时，逐渐减少到A组水平(Fig. 3d)。

图3 各组的土壤中，门水平细菌（a）和真菌（b）及纲水平细菌（c）和真菌（d）相对丰度的变化。在细菌属水平，B组中副杆菌，异种杆菌，前列腺杆菌，嗜酸杆菌，黄杆菌，农杆菌，巴氏杆菌，庞氏杆菌，克氏杆菌和节杆菌的相对丰度明显较低，占1.5％(Fig. 4a, S5)。随着玉米再植时间延长，嗜酸杆菌和黄杆菌的丰度逐渐恢复。相应地，B组具有更高的DA101，分枝杆菌，Rhodoplanes, Pedobacter, Rhodanobacter和芽孢杆菌的相对丰度。除了DA101没有随着玉米再植时间的延长而变化外，其他菌群逐渐恢复到A组水平(Fig. 4a,S6)。在真菌属水平上，B组具有显著更低的Myrothecium, Volutella, Wardomyces, Thelebolus, Leptosphaeria, Passalora,Truncatella, 原霉菌，Toninia, Rachicladosporium,Hydnum和Marasmiellus, 占1.5％(Fig. 4b, S7)。其中，随着玉米再植时间的延长，三个属（Myrothecium, Hydnum和Rachicladosporium）逐渐恢复，而另三个属（Marasmiellus, Leptosphaeria和Volutella）没有明显变化。此外，在玉米再植的农田中，其中三个属（Thelebolus, Wardomyces和Passalora）始终处于较低水平。E组中仅Thelebolus和Wardomyces逐渐恢复。有趣的是，Toninia的丰度在C组有所回升，但在D组又再次下降。相应地，Retroconis, Chaetomium, Pseudeurotium, Hypomyces, Phialemonium, Rhinocladiella, Leptodiscella, Torrubiella, Monodictys 和 Cladosporium 的丰度在B组中较高，需要更长的玉米再植时间才能恢复至A组水平。尽管在玉米再植期间， Retroconis 和 Chaetomium 出现不同程度上波动，但最终也恢复到了A组水平(Fig. 4b,S8)。

图4 各组土壤中相对丰度显著改变的细菌及真菌的层次聚类热图。

5 Beta多样性及微生物与环境因子的相关性分析

与PCoA和NMDS分析结果一致(Fig.S3, S4), UniFrac距离分析发现西洋参对土壤微生物群落有显著影响(Table 1)。PC1（30.51％），PC2（13.42％），以及PC3（11.39％）将细菌群落区分 (Fig. S3a, b, c)；PC1（17.88％），PC2（12.98％），和PC3（10.44％）将真菌群落区分(Fig.S3d, e, f)。冗余分析结果表明，土壤理化性质变化对塑造微生物群落的结构和组成起着重要作用。在不同的农田土壤中，SM，NN，SS，SOC和CN的变化对细菌群落结构和组成具有显著的影响作用；而pH，TP，AN，AP和TN变化的影响作用则相对较小(Fig. 5a)。土壤pH，SM，NN，SS和CN的变化对真菌群落结构和组成具有明显的影响；而AP，OC，AN，TN和TP的变化对真菌的影响作用相对较小(Fig. 5b)。表1 基于UniFrac距离的细菌和真菌的Adonis分析。

在细菌门水平上，平均相对丰度大于0.5％细菌门都与TN，CN和OC的变化表现出不同程度的负相关，尤其是OD1，Verrucomicrobia，Gemmatimonadetes，放线菌和酸杆菌。SS，AN，NN和AP与硝化螺旋菌，WS3，厚壁菌，绿弯菌，变形菌，放线菌和酸杆菌具有很强的正相关，而与蓝藻细菌，扁平菌和拟杆菌则具有较强的负相关。此外，pH和SM与硝化螺旋菌，WS3，厚壁菌，绿弯菌，变形杆菌，酸性杆菌，放线菌和芽孢杆菌属显著负相关，而与蓝藻细菌，扁平菌和拟杆菌具有明显的正相关。WS3与TP与硝化螺旋菌正相关，而疣状微生物，拟杆菌和浮霉菌与TP显著负相关(Fig. 5a)。在真菌门水平上，Ichtyosporea与TP，pH和CN负相关，而与SS，TN，AN，NN和AP明显正相关。Basidiomycota，Blastocladiomycota和Chytridiomycota与TN，AN，OC，TP，AP和SM表现出不同程度的负相关，而Blastocladiomycota和Chytridiomycota与pH正相关。担子菌门和壶菌门与SS和NN正相关，而子囊菌与TN，AN，OC，TP，AP和SM正相关。另外，接合菌门与pH和TP负相关，而与TN，AN和AP正相关(Fig. 5b)。根据RDA的结果， A和B组之间，在细菌属水平上具有显著的差异。SE，TN，AN，NN和AP与Pedobacter，Rhodanobacter，Rhodoplanes和Bacillus正相关，而与Opitutus，Prosthecobacter，Adhaeribacter和Balneimonas显著负相关。pH和CN与DA101，Pedobacter，分枝杆菌，Rhodanobacter，Rhodoplanes和芽孢杆菌明显负相关，而与Adhaeribacter，Luteolibacter，Skermanella和Balneimonas正相关(Fig. 5c)。在真菌属水平上，与A组相比，B组中所有丰度升高的真菌，与pH，CN，TP和SM呈不同程度的负相关；而所有丰度明显降低的真菌，除了Monodictys，都与其正相关。相反，与A组相比，B组所有丰度明显减少的真菌，与SS，AN和NN负相关；而所有丰度显著增加的真菌均与其正相关。此外，除了Retroconis，Chaetomium，Leptodiscella和Toninia与TN负相关外，所有显著变化的真菌均与TN正相关。此外，Retroconis，Rhinocladiella，Phialemonium，Chaetomium，Leptodiscella和Toninia与SOC负相关，Torrubiella 和 Hypomyces与SOC无关，其他明显改变的真菌均与SOC正相关(Fig. 5d)。

图5 各组土壤样品中主要细菌门，主要真菌门及显著变化的细菌属和真菌属的冗余分析。蓝色箭头表示菌群物种，红色箭头表示土壤的理化指标。箭头的位置和长度分别代表理化指标对微生物群落影响的方向和强度。

讨论

1 土壤的pH值，盐含量和氮含量是导致西洋参连作障碍的重要理化因素土壤理化性质的改变说明SE，SS，NN和pH在西洋参的连作障碍中起着极其重要的作用。西洋参连作障碍很可能归因于土壤pH值的降低以及SE，SS和NN含量的增加。我们的结果表明，B组的土壤pH值明显低于A组，而随着玉米再植时间的延长逐渐恢复(Fig. 1b)。此外，先前的研究也表明了，连续种植2年，3年和4年的西洋参的根重分别下降了24％，17％和32％。玉米和小麦轮作5年后西洋参的幼苗成活率从30％增加到85％左右。我们推测土壤pH值下降可能是西洋参产量下降的一个重要原因。此外，我们发现再植玉米的土壤pH值可能随着再植时间的延长而逐渐增加并接近A组，因为再植玉米4年后土壤pH值开始显著增长。土壤的pH值可以影响土壤的所有化学，物理和生物方面的特性。之前的研究认为土壤pH值与SOC，TN和CN相关，并且与土壤中NH4+和NO3-释放量的变化有关。我们研究提示土壤pH与TN，AN和NN呈负相关(Table S3)。此外，我们的实验还发现了，TN,，AN和NN含量显著增加在新种植西洋参的土壤中，并且随着玉米再植而逐渐恢复(Fig. 1f, g, h)。这些结果表明种植西洋参引起的土壤pH值变化可能会导致土壤氮含量变化，因为土壤-植物系统中氮素的初级转化受NH4+ -N和NO3--N浓度的影响。有机氮矿化作用是通过在氨化过程中首先消耗H+，然后在硝化过程中释放H+，从而改变土壤pH值。我们的研究也发现了土壤的pH值与NN负相关。这些结果表明TN，NN和AN的变化是西洋参连作障碍的重要影响因素。随着TN的变化，西洋参栽培后CN显著下降，再植玉米后通常恢复到对照组水平(Fig. 1k)。这些结果表明，种植西洋参时应更加注意氮肥的施用。CN还是土壤微生物群落组成的重要调节因素，并且与土壤pH值有关。这也解释了CN与土壤pH值之间的正相关关系(Table S3)。此外，我们发现B组的SE和SS显著高于A组，再植玉米2年后又恢复到A组水平(Fig. 1c, d)。这一结果表明，土壤盐分含量的增加与西洋参连作障碍是相关的并且具有潜在的可逆性。之前已有大量研究表明土壤盐分含量对于植物生长很重要。当前研究认为，当表层土壤盐分含量小于0.5g/kg时，农作物生长最佳。当土壤盐分含量在0.5-4g/kg之间时，作物生长受到限制，而当土壤盐分含量大于4g/kg时，作物几乎不生长。我们的研究表明了西洋参的种植显著的增加了土壤盐分含量，从A组的不足0.4g/kg到B组的接近1g/kg。当长时间再植玉米后，土壤盐含量显著下降至种植西洋参之前的水平，并保持在该水平。该结果表明了开发有效的方法来降低西洋参栽培后的土壤盐分含量可能有助于缓解西洋参的连作障碍问题。

2 土壤纤维素酶和碱性磷酸酶是影响西洋参连作障碍的重要土壤酶

土壤的酶活性是反映土壤质量和肥力的最重要指标。我们发现西洋参连续种植土壤中的中性磷酸酶活性(Fig. 2a)显著增加，而碱性磷酸酶(Fig. 2b)和纤维素酶活性(Fig. 2d)明显减少。CN，C和N来源的类型以及它们各自的浓度是影响纤维素酶产量的重要因素。多项研究表明，纤维素酶可能影响微生物活性，而与连作障碍相关的纤维素酶活性的降低与Myrothecium, Volutella和Thelebolus有关，它们均参与纤维素酶活性的产生。我们发现Myrothecium，Volutella和Thelebolus的相对丰度在B组显著降低。这解释了纤维素酶活性与Myrothecium和Thelebolus的相对丰度之间的正相关(Table S4)。另外，Chaetomium相对丰度的变化与纤维素酶活性显著负相关。Chaetomium是一种可以分解纤维素的真菌，存在于各种植物残渣及富含纤维素的基质和土壤中。随着玉米再植时间的延长，土壤中的纤维素酶活性逐渐恢复。这说明纤维素酶活性是导致西洋参连作障碍的关键因素，并且受土壤微生物群落变化的影响。与A组相比，B组的碱性磷酸酶（AlkP）活性显著降低，C组进一步降低，然后逐渐恢复(Fig. 2b)。以前的研究发现随着土壤pH值的增加，AlkP会增加。这些报告表明AlkP与土壤pH值正相关。结合微生物分析结果，我们认为碱性磷酸酶是影响西洋参连作的另一种至关重要的细胞外酶，并且与微生物群落结构和组成的变化密切相关。

3 土壤微生物群落的变化与土壤理化和酶活性的变化密切相关

在这项研究中，我们表征了种植西洋参和再植玉米的农田土壤微生物群落结构和组成的变化。我们发现，种植西洋参后土壤中细菌的多样性降低，而真菌的多样性以及细菌和真菌的丰富度都趋向于更高。此外，皮尔森（Pearson）相关性分析表明土壤pH与细菌多样性正相关，但它与真菌多样性负相关(Table S6)。具体来说，在细菌门的水平上，细菌群落组成主要由拟杆菌，变形杆菌，扁平菌，酸性杆菌，放线菌等组成。酸性杆菌被认为具有广泛的代谢和遗传功能。土壤pH是影响酸性细菌群落组成和结构的关键因素之一，而酸性细菌对土壤pH值表现出强大的反向响应。酸性细菌的相对丰度随着土壤pH值的降低而增加。根据RDA，我们发现酸性细菌与土壤pH呈极显著的负相关(Fig. 5a)。相比之下，西洋参种植的土壤中，硝化螺旋藻（0.8％）和WS3（0.9％）的丰度显著增加，并在再植玉米的土壤中逐渐恢复到栽培前的水平(Fig. 6)。该结果表明硝化螺旋藻和WS3丰度的增加可能是西洋参连作障碍的重要潜在因素。此外，我们还发现硝化螺旋藻的相对丰度与AN和NN正相关(Table S7, Fig. 5a)。与之前的研究结果一致，较高丰度的硝化螺旋藻加强了土壤微生物群落对氮素开采利用。在细菌属水平上，种植西洋参后芽孢杆菌的相对丰度显著增加。大多数芽孢杆菌可以抑制病原微生物在土壤中的繁殖。此外，它们还可以入侵植物的根部，减少植物中的土传疾病，调节和平衡土壤的pH值，调节植物根部的生态环境，并形成优势生态位，以缓解化肥，农药和其他有害因素对土壤造成的破坏。因此，芽孢杆菌的增加可能归因于土壤理化性质，微生物群落结构和成分的变化，特别是在pH的降低，SS以及有害细菌和真菌的增加。Opitutus通过将硝酸盐还原为亚硝酸盐而促进了N循环，而其他细菌会进一步将其转化为亚硝酸盐。Opitutus相对丰度的变化与TN和NN显著负相关。某些变形杆菌，例如农杆菌，Balneimonas和Skermanella明显减少。在真菌门水平上，真菌群落主要由子囊菌，担子菌和合子菌组成，这与以前的研究结果一致。与A组相比，B组中几乎所有明显改变的真菌都是子囊菌和担子菌。先前研究认为，子囊菌和担子菌属是主要的土壤真菌分解剂。土壤微生物群落分解农作物残留物是从植物残留物中释放无机养分的关键一步。与A组相比，B组中真菌显著增加，与SE，SS，AN和NN显著正相关(Table S8)。此外，土壤SE和SS与Torrubiella，Cladosporium，Rhinocladiella和 Phialemonium显著正相关，而NN与Torrubiella，Rhinocladiella和Cladosporium显著正相关。先前的研究认为土壤pH值对以中性土壤为主地区的植物多样性产生积极影响，但对酸性土壤为主地区的植物多样性产生负面影响。这表明了真菌丰度的变化与土壤pH密切相关。土壤pH与Myrothecium，Truncatella和Protomyces呈正相关，而与Chaetomium , Cladosporium 和Leptodiscella呈负相关。Myrothecium广泛存在于植物和土壤中，具有很强的分解纤维素的能力。一些菌株会产生抗生素，这与纤维素酶活性的降低有关。Myrothecium相对丰度的变化与纤维素酶活性显著正相关。作为一种重要的纤维素分解真菌，Chaetomium在自然生态系统的碳循环和土壤改良中起着至关重要的作用。Chaetomium相对丰度变化与土壤pH值呈负相关，与SS呈正相关。此外，作为潜在的生物防治真菌，与A组相比，Hydnum相对丰度在B组显著降低，且与土壤pH呈负相关，与SS呈正相关。一项研究表明，Hydnum可能与多种木本和草本寄主植物的根腐病有关。

图6 和A组相比，B组显著变化的细菌门。

总结

总之，我们认为细菌和真菌群落结构的变化是导致西洋参连作障碍的重要因素；而平衡土壤pH可能是改善真菌群落多样性和丰富度以解决西洋参连作障碍的必要先决条件。在实际的耕作中可以采取许多有效措施，例如添加有机改良剂以调节土壤pH，氮素利用率和微生物群落的组成。此外，木灰和石灰施肥可以显著增加和改善土壤pH以适合植物生长。

来源：健康界